材料與方法

1.1 酶解發(fā)酵豆粕的制備

參考魏金濤等的方法，在塑料桶中加入10ｋｇ粒徑12目的豆粕，按300U/ｇ 添加木瓜蛋白酶、2×107 CFU/ｇ 接種植物乳桿菌之后加入37℃溫水30ｋｇ，攪拌均勻后置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中酶解發(fā)酵24ｈ，所得豆粕酶解發(fā)酵物用于配制飼糧。飼喂用的豆粕酶解發(fā)酵物均在配料前1天的07：00和15：00各制備1次。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照品種、胎次基本一致的原則，將144 頭9日齡健康的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交育肥仔豬隨機(jī)分為３ 組，每組６個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)８ 頭豬（公母各占1/2）。陰性對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧＋60ｇ/ｔ 吉他霉素，試驗(yàn)組飼喂試驗(yàn)飼糧（基礎(chǔ)飼糧中10％豆粕被豆粕酶解發(fā)酵物替代）。預(yù)試期7ｄ，正試期42ｄ。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)場(chǎng)地采用漏縫地板，豬只自由采食，自由飲水。免疫消毒程序按照豬場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)飼糧

飼糧參照NRC（2012） 豬的營(yíng)養(yǎng)需要并結(jié)合所在豬場(chǎng)實(shí)際制定配方，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。陰性對(duì)照組飼糧飼喂前添加自來(lái)水做成濕拌料，***計(jì)算水的添加量，保證飼糧中含水量為28％左右。

1.4 樣品的采集與制備

1.4.1 血液采集與血清的制備

在正試期第42天從每組選取6頭豬，抽取頸靜脈血靜置后3000r/min 離心10min，制備的血清置于-70℃ 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 盲腸內(nèi)容物的采集

在正試期第42天從每組選取6頭豬，頸部放血致死，無(wú)菌條件下取十二指腸、盲腸和大腸內(nèi)容物于滅菌的凍存管中，并迅速將凍存管放于充滿液氮的液氮罐中，備測(cè)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 試驗(yàn)儀器

AUY-220型電子分析天平，日本島津UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，德國(guó)福斯FOSS-2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀，羅氏MODULP-800全自動(dòng)生化分析儀，EDC-810PCR擴(kuò)增儀，JY300水平電泳儀，JY-02S 紫外分析儀。

1.5.2 營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定按照GB/T6432-1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》進(jìn)行；小肽含量測(cè)定按照GB/T22492-2008《大豆肽粉》方法進(jìn)行；水溶性蛋白含量測(cè)定按照NY/T1205-2006《大豆水溶性蛋白含量的測(cè)定》方法進(jìn)行；乳酸桿菌數(shù)量的測(cè)定采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。

1.5.3 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

分別在試驗(yàn)開(kāi)始與試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，以個(gè)體為單位對(duì)所有試驗(yàn)豬進(jìn)行空腹稱重；試驗(yàn)過(guò)程中詳細(xì)觀察與記錄仔豬健康和生長(zhǎng)狀況、采食量、腹瀉等情況。計(jì)算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率等。

1.5.4 血清指標(biāo)的測(cè)定

血清生化指標(biāo)的測(cè)定采用羅氏MODULP-800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量等測(cè)定采用試劑盒法，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5.5 腸道菌群結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定腸道中總細(xì)菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)。引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照北京天根基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取腸內(nèi)容物DNA，通過(guò)將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠進(jìn)行回收，純化分別獲得總細(xì)菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)品，然后將細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以不同標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，將待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)樣品的Ct值，并將其和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，獲得各個(gè)樣品中細(xì)菌數(shù)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），不同組間的平均值差異用Student-Newman-Keuls（S-N-K） 比較 。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2結(jié)　果

2.1 豆粕酶解發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分變化

從表３ 可知，豆粕酶解發(fā)酵前后總能及粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣和總磷含量差異不顯著（P＞0.05）；但是豆粕酶解發(fā)酵物中的小肽和水溶性蛋白含量比豆粕分別提高了3.56倍和4.76倍（P＜0.05），乳酸桿菌數(shù)量達(dá)到6.14×109CFU/ｇ。

2.2 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

從表4可知，試驗(yàn)組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量分別比陰性對(duì)照組提高5.06％、10.07％、5.03％（P＜0.05），腹瀉率比陰性對(duì)照組降低39.59％（P＜0.05）；試驗(yàn)組與抗生素對(duì)照組相比各指標(biāo)差異均不顯著（P ＞0.05），但是平均日增重和平均日采食量都有高于抗生素對(duì)照組的趨勢(shì)。

2.3 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬血清指標(biāo)的影響

從表５ 可知，試驗(yàn)組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于陰性對(duì)照組（P ＜0.05），其他指標(biāo)差異不顯著（P ＞0.05）；試驗(yàn)組和抗生素對(duì)照組仔豬血清生化指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

從表6可知，試驗(yàn)組仔豬血清T-AOC、SOD 活性、MDA 含量與陰性對(duì)照組相比均有顯著改善（P＜0.05），與抗生素對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

從表７ 可知，試驗(yàn)組仔豬盲腸、大腸中乳酸桿菌數(shù)量顯著高于陰性對(duì)照組和抗生素對(duì)照組（P＜0.05）；豆粕酶解發(fā)酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數(shù)量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數(shù)量增加幅度越大；試驗(yàn)組仔豬腸道中盲腸、大腸中的大腸桿菌數(shù)量有低于抗生素對(duì)照組和陰性對(duì)照組的趨勢(shì)（P＞0.05）。試驗(yàn)組十二指腸中總細(xì)菌數(shù)比陰性對(duì)照組和抗生素對(duì)照組低（P ＜0.05），各組間盲腸、大腸中總細(xì)菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

3討　論

3.1 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

潘翠玲等發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解物能克服早期斷乳應(yīng)激引起的仔豬食欲下降、腹瀉和生長(zhǎng)遲滯等不良現(xiàn)象。付曉等報(bào)道酶解豆粕組仔豬粗蛋白質(zhì)、鈣和磷消化率均高于對(duì)照組。這都說(shuō)明了豆粕酶解后更容易被仔豬消化吸收。詹湉湉等報(bào)道豆粕合理的發(fā)酵時(shí)間為72ｈ，料水比為1∶0.7，寡肽和游離氨基酸含量可達(dá)2.48％。胡瑞等將豆粕液態(tài)發(fā)酵發(fā)酵時(shí)間為48ｈ，但是加入蛋白酶后發(fā)酵豆粕游離氨基酸含量提高了0.36％，大分子蛋白質(zhì)降解程度顯著升高。本研究利用木瓜蛋白酶和植物乳桿菌在液態(tài)酶解發(fā)酵豆粕24ｈ后小肽含量達(dá)到了9.63％，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)組仔豬的末重、平均日增重、平均日采食量略優(yōu)于抗生素對(duì)照組， 和陰性對(duì)照組相比提高了5.06％、10.07％、5.03％。這主要是由于豆粕酶解發(fā)酵后大分子蛋白被分解，提高了部分氨基酸含量，部分抗?fàn)I養(yǎng)因子被降解，而且豆粕在液態(tài)下經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后產(chǎn)生大量乳酸等，使得所配制飼料具有酸香味，刺激動(dòng)物食欲。本文中試驗(yàn)組仔豬腹瀉率比陰性對(duì)照組低39.59％，與抗生素對(duì)照組差異不顯著，據(jù)呂剛等報(bào)道酶解豆粕濕喂仔豬組全期料重比、腹瀉指數(shù)優(yōu)于干燥酶解豆粕組。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了豆粕酶解發(fā)酵后不經(jīng)干燥直接配制飼糧，提高了飼糧適口性，有益于動(dòng)物生長(zhǎng)性能的提高，可以實(shí)現(xiàn)仔豬飼料中不添加促生長(zhǎng)性抗生素。但是中國(guó)南方高溫季節(jié)采用濕的豆粕酶解發(fā)酵物一定要防止原料久置變質(zhì)。

3.2 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬血清指標(biāo)的影響

血清堿性磷酸酶活性高低可以反映動(dòng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組仔豬的堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明豆粕酶解發(fā)酵物可以促進(jìn)仔豬蛋白質(zhì)吸收，提高鈣磷利用率，這與生長(zhǎng)性能的表現(xiàn)呈一致性。機(jī)體內(nèi)存在的各種抗氧化酶能夠互相合作共同構(gòu)成機(jī)體對(duì)自由基的**道防線。血清MDA含量的高低間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組仔豬血清T-AOC、SOD活性顯著高于陰性對(duì)照組，MDA含量顯著低于陰性對(duì)照組，說(shuō)明豆粕酶解發(fā)酵物提高了仔豬機(jī)體抗氧化能力，減少自由基對(duì)機(jī)體的傷害。

3.3 豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

健康仔豬腸道中多種細(xì)菌數(shù)量都隨腸段后移而逐漸增加。乳酸桿菌是豬腸道正常菌群中的重要優(yōu)勢(shì)菌。若仔豬發(fā)生腹瀉，仔豬腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量會(huì)發(fā)生改變，如乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量會(huì)降低，大腸桿菌的數(shù)量增加。本研究中試驗(yàn)組仔豬盲腸、大腸段乳酸桿菌數(shù)量顯著高于陰性對(duì)照組和抗生素對(duì)照組；豆粕酶解發(fā)酵物使腸道各部位食糜中乳酸桿菌數(shù)量大幅度提高，且隨著腸段后移，乳酸桿菌數(shù)量增加幅度越大。試驗(yàn)組十二指腸中總細(xì)菌數(shù)比陰性對(duì)照組和抗生素對(duì)照組低，且十二指腸段總細(xì)菌數(shù)低于盲腸、大腸。這主要是由于十二指腸細(xì)菌的種類及數(shù)量極少，胃酸、膽汁作用及小腸液流量大，蠕動(dòng)節(jié)奏快，細(xì)菌在繁殖前即被沖洗到遠(yuǎn)端回腸及結(jié)腸。試驗(yàn)組仔豬腸道中乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，擠占了大腸桿菌的生存空間，使得大腸桿菌數(shù)量下降，試驗(yàn)豬只腹瀉率降低。本試驗(yàn)中抗生素選用的為目前在家禽和豬飼料中廣泛使用的吉他霉素，吉他霉素可以使豬腸道中大腸桿菌數(shù)量顯著減少，對(duì)乳酸桿菌數(shù)量卻沒(méi)有顯著影響。仔豬腸道菌群由乳酸桿菌、雙歧桿菌、小梭菌等厭氧菌以及腸桿菌、腸球菌等需氧菌組成，后期研究中筆者將對(duì)仔豬腸道中的雙歧桿菌、腸球菌等進(jìn)行分析定量，更為擁有地了解豆粕酶解發(fā)酵物對(duì)仔豬腸道中菌群結(jié)構(gòu)的影響。

4結(jié) 論

豆粕酶解發(fā)酵物能促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育，提高生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，利于乳酸桿菌在腸道內(nèi)形成優(yōu)勢(shì)菌群。